R4-31 Narzędzia i techniki w inżynierii genetycznej

Warto powtórzyć R1-10

1. Ważne enzymy

polimerazy DNA

• "molekularni budowniczowie"
• przy użyciu deoksynukleotydów powielają fragmenty DNA
• potrzebują:
• matrycy (DNA lub RNA) do której dobudowują komplementarną nić (wyjątek: TDT-aza)
• startera (krótka sekwencja nukleotydów) do rozpoczęcia syntezy
• polimerazy termostabilne - nie ulegają denaturacji (tak szybko) nawet w wysokich temperaturach. 
• polimeraza Taq
• izolowana z Thermus aquaticus
• ekstremalnie termofilna bakteria odkryta w gorących źródłach Yellowstone
• jej optymalna temperatura do życia to 100𝇈C
• czas półtrwania to 40 min w 95𝇈C
• przeprowadza reakcję w temperaturze ok 74𝇈C

ligazy

• "molekularny klej"
• wytwarzają wiązania fosfodiestrowe, łącząc ze sobą fragmenty DNA.
• reakcja ligacji

enzymy restrykcyjne (restryktazy)

• "molekularne nożyczki"
• każda restryktaza rozpoznaje określoną sekwencję (miejsce restrykcyjne) i rozrywa w tym miejscu wiązania fosfodiestrowe, czyli rozcina DNA.
• mapy restrykcyjne plazmidów, to grafiki które wskazują miejsca na cząsteczce cięte przez różne enzymy restrykcyjne.
• miejsce restrykcyjne są zazwyczaj:
• zbudowane z 4-8 pz (czyli par zasad)
• palindoromowe (sekwencja 5'-3' jest taka sama na obu niciach)
• restryktazy powodują, że na niciach powstają tępe lub lepkie końce. Do lepkich końców łatwiej "doklejać" nukleotydy.

2. Denaturacja DNA

Wiązania wodorowe łączą z sobą nukleotydy dwóch sąsiednich nici DNA. 

Ulegają one denaturacji w ok 95𝇈C (zależne od ilości par G≡C/A=T), co powoduje rozerwanie helisy DNA na dwie pojedyncze nici. 

Obniżenie temperatury powoduje ponowne powstawanie tych wiązań, czyli łączenie się nukleotydów komplementrnych sekwencji (tych ze starej nici lub "naszego dodatku").

3. Ładunek DNA

Od zewnętrznej strony DNA ma reszty kwasu fosforanowego. W efekcie - jego ładunek na powierzchni będzie ujemny. Jeśli podłączymy elektrody (katodę [-] i anodę [+]) po dwóch przeciwległych stronach, to ujemnie naładowane DNA "popłynie do plusa".

4. Hybrydyzacja DNA

cel: wykrywanie określonej sekwencji DNA na chromosomowach

potrzebne: sonda molekularna - krótka sekwencja, która jest komplementarna do szukanej sekwencji, ma dołączone związki fluorescencyjne.

przebieg: 

1. denaturacja DNA (jego rozpad na dwie nici)
2. łączenie się DNA z sondą molekularną (jeśli jest komplementarny fragment dla sondy)
3. obserwacja występowania świecenia fluorescencyjnego (czy jest, jak jest to gdzie).

warto znać:

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) - utrwalamy najpierw chromosomy na szkiełku. Możemy określić, na których chromosomach zlokalizowana jest poszukiwana sekwencja.

Mikromacierze - technika pozwalająca na jednorazowe sprawdzenie kilkudzisięciu tysięcy sekwencji. Na płytce (mikromacierzy) znajdują się nieoznakowane sondy, nanosimy znakowane DNA. 

5. Elektroforeza DNA

cel: rozdział DNA ze względu na wielkość cząsteczek

potrzebne: fragmenty DNA (mogą być barwione np. bromkiem etydyny), pojemnik z żelem elektroforetycznym (porowaty, w jego "dziurach" przemieszcza się DNA), katoda (-) i anoda (+), WARTO: marker (DNA pocięte na fragmenty o znanej nam ilości pz (par zasad).

przebieg: 

1. DNA nanosimy pipetą do rowków w żelu elektroforetycznym. 
2. Wraz z prądem cząsteczki DNA przemieszczają się w kierunku anody.
3. Małe cząsteczki łatwiej przemieszczają się w porach żelu, więc wędrują szybciej, a duże cząsteczki wolniej.
4. Po rozdziale widać prążki (jeśli daliśmy barwnik) - fragmenty DNA o tej samej długości. Przy użyciu markera możemy dokładnie powiedzieć jakiej ile pz)
5. Interesujący nas fragment można wyciąć z żelu i wykorzystywać dalej (jeśli go trwale nie zniszczyliśmy np. bromkiem etydyny).

6. Analiza restrykcyjna

Polega na pocięciu DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych, czyli w określonych miejscach. W połączeniu z elektroforezą ma wiele zastosowań np:

• chcemy zmodyfikować plazmid, umieszczając w nim nowy gen.
• musieliśmy rozciąć wektor (plazmid), a następnie ligazą połączyć go ze wstawką (dodawanym fragmentem).
• możliwe efekty:
• brak wbudowania wstawki,
• wstawka wbudowana w prawidłowej orientacji,
• wstawka wbudowana w odwrotnej orientacji.
• sprawdzamy, co wyszło:
• tniemy plazmid w miejscu restrykcyjnym, które znajduje się na wstawce i wektorze.
• przeprowadzamy elektroforezę tych fragmentów
• analizujemy długości fragmentów

LINK DO WIRTUALNEGO LABORATORIUM ZPE

7. PCR - Reakcja łańcuchowej polimerazy

cel: namnażanie DNA

potrzebne: 

• matryca DNA (kopiowana cząsteczka DNA)
• wolne nukleotydy DNA (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) - z nich tworzymy kopie
• starter DNA
• krótki fragment DNA, komplementrany do matrycy DNA
• umożliwia start pracy polimerazy
• łączy się z DNA w ok. 40-60𝇈C (zależy od sekwencji starteru)
• termostabilna polimeraza DNA np. Taq

przebieg: 

1. Podgrzanie mieszaniny do 95𝇈C - denaturacja DNA (jego rozpad na dwie nici)
2. Schłodzenie do ok. 50𝇈C - łączenie się DNA z starterami
3. Podgrzanie do 70𝇈C - polimeraza syntetyzuje nowe komplemetrane nici

I tak z 30 razy... o każdym cyklu powstaje 2ⁿ cząsteczek, czyli po 30 cyklach z 1 cząsteczki DNA otrzymamy 1073741824 cząsteczek DNA

8. Sekwencjonowanie DNA metodą Sangera

cel: ustalenie sekwencji DNA

potrzebne: 

• matryca DNA (kopiowana cząsteczka DNA)
• wolne nukleotydy DNA
• znakowane dideoksynukleotydy
• dideoksynukleotydy nie mają grupy -OH, potrzebnej do przyłączania kolejnych nukleotydów
• ich wbudowanie kończy dołączanie kolejnych nukleotydów
• każdy rodzaj jest inaczej znakowany, więc wiemy czy wbudowano w tej pozycji T cy G itd.
• starter DNA
• polimeraza DNA

przebieg: 

1. Polimeraza syntezuje nowe cząsteczki DNA, zakończone znakowanymi nukleotydami.
2. Cząsteczki mają różne długości/ilość pz. Rozdzielane są poprzez elektroforezę.
3. Detektor odczytuje, jaki wyznakowany nukleotyd został wbudowany i na jakiej pozycji.
4. Dane są zbierane i otrzymujemy sekwencję nukleotydów.